Indinavir 37

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Mécanisme d'hyperbilirubinémie induite par l'indinavir Abstrait L'indinavir est un inhibiteur de protéase virale utilisée pour le traitement de l'infection par le VIH. hyperbilirubinémie se développe dans jusqu'à 25% des patients recevant l'indinavir, provoquant l'arrêt du médicament et une nouvelle évaluation clinique dans certains cas. Nous avons postulé que ce effet secondaire est due à la dépréciation de la bilirubine UDP-glucuronosyltransferase (UGT) activité indinavir médiation et serait le plus prononcé chez les personnes ayant des taux d'enzymes hépatiques réduites, comme cela se produit dans ≈10% de la population manifestant le syndrome de Gilbert. Cette hypothèse a été testée in vitro. dans le modèle de rat Gunn de déficience UGT, et chez les patients infectés par le VIH avec et sans le polymorphisme du Gilbert. L'indinavir a été trouvé à inhiber de manière compétitive l'activité enzymatique UGT (K I = 183 pM) tout en induisant concomitantly bilirubine UGT ARNm et la protéine expression hépatique. Bien que l'indinavir orale taux de bilirubine plasmatiques dans de type sauvage et les rats Gunn hétérozygotes a augmenté, la hausse moyenne était significativement plus élevé dans ce dernier groupe d'animaux. De même, la bilirubine sérique a augmenté en moyenne de 0,34 mg / dl chez les patients atteints du VIH traitées indinavir dépourvues de polymorphisme de Gilbert contre 1,45 mg / dl chez ceux qui étaient soit hétérozygote ou homozygote pour l'allèle mutant. Alors que le saquinavir inhibe également l'activité compétitive UGT, ce médicament n'a pas été associée à l'hyperbilirubinémie, très probablement en raison de la plus élevée K I (360 uM) et des niveaux thérapeutiques sensiblement inférieurs par rapport à indinavir. Pris ensemble, ces résultats indiquent que les élévations de la bilirubine sérique-non conjugué associé à un résultat de traitement indinavir de l'inhibition directe de l'activité de la bilirubine-conjugaison. La protéase du VIH est une enzyme essentielle qui clive gag virale et de chaînes de polypeptides gag-pol en protéines fonctionnelles plus petites. Blocage des résultats de l'activité de la protéase virale dans la libération des virions structurellement désorganisées et non infectieuses (1). L'indinavir est un puissant inhibiteur de protéase qui, lorsqu'il est utilisé en association avec des inhibiteurs de la transcriptase inverse, a été montré pour supprimer efficacement la réplication virale, de réduire la morbidité, et de prolonger la survie chez les patients infectés par le VIH (2. 3). Malheureusement, la thérapie indinavir est associée à une incidence 6-25% du asymptomatique, hyperbilirubinémie (2 -5) en l'absence de lésions hépatiques histologiques (6). Les patients chez lesquels une accumulation excessive de bilirubine conduit au développement d'une jaunisse clinique ont été soumis à l'interruption du traitement et l'investigation clinique supplémentaire. Bilirubine, le produit principal de catabolisme de l'hème, est éliminé de la circulation par le foie où il est conjugué avec l'acide glucuronique pour former des métabolites solubles dans l'eau destinés à la sécrétion dans la bile. La réaction de glucuronidation est médiée par l'enzyme microsomale, de la bilirubine UDP-glucuronyltransférase (UGT). Un total de 15 isoformes UGT humaines ont été identifiées, chacune avec des spécificités de substrat distinctes (7). Parmi ceux-ci, huit sont codés par le locus UGT1A, y compris l'isoforme spécifique de la bilirubine (UGT1A1). La spécificité de substrat d'enzymes UGT1A est conférée par l'exon 1, tandis que la séquence carboxyle, codée par les exons 2 à 5, est conservée entre les différentes isoformes (7). Le métabolisme de l'indinavir se produit principalement par le cytochrome P450 3A4 isoenzyme. Cependant, l'identification d'un métabolite glucuronide de l'indinavir (8. 9) suggère que ce médicament peut également servir de substrat pour l'UGT. Ce constat nous a conduit à postuler que les niveaux sériques de bilirubine élevée résultent d'un effet inhibiteur de l'indinavir sur conjugaison de la bilirubine, et que l'hyperbilirubinémie sera plus prononcée chez les personnes manifestant le métabolisme de la bilirubine avec facultés affaiblies. Un exemple commun est le syndrome de Gilbert, d'un défaut héréditaire de l'activité hépatique de la bilirubine conjugaison qui affecte 5 à 10% de la population générale (10. 11). Cette condition bénigne est causée par un polymorphisme dans le promoteur de l'élément TATA du UGT1A1 gène codant, conduisant à une insertion dans le TA type sauvage A (TA) 6 séquence d'AAT (12). homogénats de foie provenant d'individus homozygotes pour l'A du Gilbert (TA) 7 TAA génotype présentent une réduction de 50% de l'activité de la bilirubine de conjugaison (13). Compte tenu de la fréquence élevée de ce polymorphisme (11 -14), nous pensons que l'hyperbilirubinémie induite par l'indinavir se manifeste principalement chez des patients possédant l'allèle de Gilbert. Pour élucider le mécanisme de l'hyperbilirubinémie induite par indinavir, nous avons examiné l'effet de ce médicament sur l'expression de l'UGT1A1 hépatique et l'activité in vitro. et, dans une souche mutante de rat (Gunn) possédant une déficience héréditaire de la bilirubine UGT. Nous avons également évalué les patients infectés par le VIH pour le polymorphisme de Gilbert et corrélé nos résultats avec les changements de traitement associés à des concentrations de bilirubine sérique. Nos données indiquent que l'indinavir entraîne une hyperbilirubinémie par inhibition compétitive de l'activité de la bilirubine UGT. Matériaux et méthodes Matériaux. La bilirubine non conjuguée (bilirubine IXα) a été obtenu à partir Porphyrin Products (Logan, UT) et encore purifié selon le procédé de McDonagh et Assise (15). Dioléoylphosphatidylcholine a été acheté chez Avanti Polar Lipids. Tous les autres produits chimiques ont été obtenus auprès de Sigma. L'isolement de microsomale de membranes de foie de rat. Les membranes microsomales ont été isolés à partir de rats Wistar mâles à jeun (250-300 g) en utilisant des méthodes établies (16). En bref, les foies ont été réséquées, homogénéisés dans du saccharose 0,25 M / EDTA 1 mM (pH 7,3) et soumis à une centrifugation à 41 000 x série g pendant 7 min et 80 000 xg pendant 23,5 min. La concentration en protéine a été mesurée en utilisant le dosage de protéine Bio-Rad. Le dosage de la bilirubine glucuronide de production. l'activité a été dosée UGT bilirubine en utilisant une modification du mode opératoire de réaction diazo de Seppen et al. (17). Des vésicules composées de dioléoylphosphatidylcholine ont été préparés par traitement aux ultrasons, comme décrit précédemment (18). des microsomes de foie de rat (10 mg de protéine / ml) ont été pré-incubées avec 12,5 mg / ml de digitonine pendant 1 h sur de la glace, puis ajouté à la dioléoylphosphatidylcholine vésicules (2,5 mg de phospholipide / ml) en suspension dans 50 mM de Tris-HCl (pH 7,8) contenant 5 mM de MgCl2 mM d'acide UDP-glucuronique /3.5 / 1 mM de 1,4-saccharolactone à une concentration finale de 2 mg de protéine / ml. Après une incubation de 10 min à 37 ° C, la réaction de glucuronidation a été initiée par addition d'une petite quantité aliquote (5% du volume total) de la bilirubine non conjuguée solubilisées dans NaOH 50 mM. Les réactions ont été réalisées en présence de diverses concentrations (0 à 500 pM), de l'indinavir et arrêtées en ajoutant 3 volumes de 0,4 M de glycine / HCl (pH 2,7). Par la suite, 1,5 volumes de réactif de diazotation (0,1 ml d'anthranilate d'éthyle, 0,3 ml de 70 mM de NaNO 2. Et 0,1 ml de 88 mM de sulfamate d'ammonium dans HCl 10 ml de 150 mM) a été ajouté au mélange (17. 19), qui était mis en incubation à température ambiante. La réaction de diazotation a été arrêtée après 30 min avec 1 volume de 570 mM d'ascorbate. Pigments azoïques ont été extraites avec 3 volumes de méthylpropylcétone / butyl-1-acétate d'éthyle (17: 3, en volume: volume) et l'absorbance de la couche organique a été mesurée à 530 nm. Les concentrations glucuronides de bilirubine ont été calculées sur la base d'un coefficient d'extinction de 44400 M -1 cm -1 (17). Évaluation de l'UDP-glucuronosyltransferase Expression dans les cellules Rat hépatome. L'effet de l'indinavir sur l'ARNm et de la bilirubine UGT expression de protéines dans des cellules d'hépatome de rat en culture H35 a été évaluée par Northern et Western Blot. Les monocouches ont été incubées pendant 18 heures dans un milieu essentiel modifié de Dulbecco contenant des concentrations variables de l'indinavir (0-50 pm). L'ARN cellulaire total a ensuite été extrait et soumis à un transfert de Northern avec une sonde d'ADNc spécifique de l'exon 1 de UGT1A1 chez le rat (bp 1-943), et avec une sonde non spécifique UGT (pb 1004-1601) comprenant les exons 2 à 5 (7). Transfert de Western a été effectuée sur des microsomes de cellules isolées par H35 en utilisant une modification du procédé de Seppen et al. (20). Les cellules ont été rompues par sonication sonde (30-s impulsion), les noyaux et les gros débris ont été éliminés par centrifugation à 4000 x série g et 41 000 x g pendant 10 minutes, et les membranes microsomales ont été centrifugées à 80 000 x g pendant 1 h. Les empreintes ont été développées avec un antisérum de lapin produit par l'injection d'une matrice de peptides antigéniques multiples contenant un peptide synthétique de 20 bis (VFGPYASHAGRLLVFPMDGS) correspondant à une portion du domaine de la bilirubine de liaison de UGT1A1 de souris (21), en utilisant le système de détection de la Renaissance ECL (NEN). Mesure des niveaux de bilirubine Plasma et hépatique chez le rat Expression UGT indinavir-traités. Après un jeûne, 250 g hétérozygote nuit (j / +) des rats Gunn et de type sauvage (+ / +) chez des rats Wistar ont été administrés 240 mg / kg indinavir, solubilisé dans 0,05 M d'acide citrique (240 mg / ml) toutes les 8 h par gavage (22). La queue d'échantillons de sang veineux (500 ul) ont été obtenues avant et 3 heures après la quatrième dose de l'indinavir, après quoi les animaux ont été tués et l'expression hépatique UGT a été évaluée par Northern et Western Blot. le taux de bilirubine plasmatiques ont été mesurées en utilisant le kit de diagnostic Sigma totale de dosage de la bilirubine, selon les instructions du fabricant. Sélection des patients et la caractérisation du UGT1A1 promoteur Génotypes. prélèvement d'échantillons pour les tests génétiques a été approuvé par le comité d'examen institutionnel. les hommes infectés par le VIH étaient admissibles à l'inscription après avoir reçu une dose standard (800 mg trois fois par jour) de l'indinavir par voie orale pour un minimum de 4 semaines. Les patients ont été choisis en fonction de la disponibilité des valeurs de bilirubine avant et pendant le premier cours d'utilisation indinavir, la capacité de fournir un consentement éclairé pour les tests génétiques pour les polymorphismes UGT1A1, et la volonté de fournir un échantillon de sang pour l'extraction de l'ADN cellulaire et de l'analyse. Des efforts ont été faits pour recruter une proportion égale de sujets qui présentaient une augmentation de la bilirubine sérique total soit supérieur ou inférieur à 0,5 mg / dl. Les patientes ont été exclues en raison de l'expression plus prononcée phénotypique du syndrome de Gilbert chez les hommes (12). L'ADN a été isolé à partir de lymphocytes du sang entier en utilisant QIAamp DNA Mini kit sanguin (Qiagen, Chatsworth, CA). L'amplification par PCR a été réalisée avec l'avant (5'-CTTGGTGTATCGATTGGTTTTTG-3 ') et arrière (5'-TTTGCTCCTGCCAGAGGTTCG-3') amorces englobant la boîte TATA UGT1A1 (23). Les produits de PCR ont été séparés sur un gel d'acrylamide à 12% et visualisés avec du bromure d'éthidium. l'identité du fragment a été confirmée en utilisant des échantillons de génotype connu, tel que déterminé par séquençage direct. les niveaux de bilirubine totale et non conjuguée, l'hémoglobine, l'alanine aminotransférase, et de l'albumine sérique ont été mesurés immédiatement avant le début du traitement de l'indinavir et après un minimum de 4 semaines de traitement. Analyses statistiques. Les données ont été analysées en utilisant un progiciel statistique assistée par ordinateur (7 Statistix, Analytical Software). Les caractéristiques démographiques des sujets humains ont été comparés en utilisant des statistiques paramétriques et non paramétriques comme approprié pour le type de données. Les taux moyens de bilirubine ont été comparés en utilisant test ANOVA avec comparaison Scheffé de moyens. régression par degrés a été utilisé pour déterminer la contribution des facteurs de risque potentiels. Une hypothèse à deux queues avec l'alpha-0,05 a été utilisé tout au long. Résultats Effet de indinavir sur bilirubine UDP-glucuronosyltransferase activité. Les premières études ont porté sur les effets modulateurs de l'indinavir sur conjugaison de la bilirubine. Comme UDP-glucuronosyltransférases sont localisés principalement dans le réticulum endoplasmique des hépatocytes (24. 25), isolé du foie membranes microsomales ont servi comme source d'activité enzymatique. L'addition de la bilirubine non conjuguée à une suspension de rat microsomes hépatiques a entraîné une augmentation du temps et dépendant de la concentration de la bilirubine dans la formation glucuronide, telle qu'évaluée par l'essai diazoïque (fig. 1 supérieure). Parce que la réaction est très linéaire sur les 3 premières minutes d'incubation, le taux initial de production glucuronide a été déterminée à ce point de temps dans des expériences ultérieures. En présence de 500 uM indinavir, la formation de bilirubine glucuronide était significativement réduite à chaque concentration de bilirubine non conjuguée étudiée (Fig. 1 bas). la conjugaison de la bilirubine par les microsomes hépatiques de rat. Bien sûr (Haute) Temps de génération de glucuronides de bilirubine après l'addition de 20 pM (■) ou 50 uM (•) bilirubine non conjuguée à une suspension de rat microsomes hépatiques (2 mg / ml de protéine). Chaque point correspond à la moyenne (± écart-type) de trois expériences et est corrigée pour l'absorbance de référence. (Basse) Le taux initial de la production de bilirubine glucuronide en présence (■) ou l'absence (●) de 500 uM indinavir est fonction de la concentration de la bilirubine non conjuguée (UCB). Pour élucider le mécanisme par lequel l'indinavir inhibe la bilirubine conjugaison, des expériences ont été menées sur une plage de bilirubine (0-50 uM) et indinavir (0-500 uM) concentrations. Un tracé réciproque des données (Fig. 2 à gauche) est compatible avec l'inhibition compétitive de l'activité de la bilirubine UGT, avec une dissociation calculée constante pour le complexe inhibiteur de l'enzyme (K I) de 183 uM. Il est à noter que les valeurs obtenues pour le K m (12,8 pM) et V max (655 pmol × mg de protéine -1 × min -1) de rat bilirubine sont UGT en accord étroit avec les résultats précédemment (7. 25. 26). Pour déterminer si cet effet est unique à l'indinavir, des études parallèles ont été réalisées avec le saquinavir (Fig. 2 à droite), un inhibiteur de protéase du VIH qui n'a pas été associé à une hyperbilirubinémie. Fait intéressant, ce médicament a également été trouvé pour inhiber de manière compétitive la conjugaison de la bilirubine, mais avec une valeur K I (360 pM), qui est nettement supérieur à l'indinavir. parcelles réciproques d'activité UGT bilirubine. (Gauche) Un tracé inverse de la vitesse initiale de formation de bilirubine glucuronide par rapport à la concentration de la bilirubine non conjuguée (UCB), mesurée en l'absence (●) ou en présence de 250 uM (▴) ou 500 pM (■) indinavir. Les points reflètent la moyenne (± écart-type) de trois expériences et sont adaptées à des fonctions linéaires (lignes continues). Les valeurs de K m (12,8 ± 1,0 uM, ± SE) et Vmax (655 ± 22 pmol glucuronide x mg de protéine x -1 min -1) de la bilirubine UGT ont été déterminées à partir de l'ajustement des données obtenues en l'absence d'indinavir à l'expression: y = 1 / V max + K m / V max. (À droite) des conditions expérimentales identiques ont été utilisées dans une analyse de l'effet de 500 uM saquinavir (■) sur l'activité UGT bilirubine (K I = 360 ± 11 pM). En l'absence de saquinavir (●), K Km et Vmax valeurs étaient de 12,9 ± 0,9 uM et 654 ± 20 pmol × × mg de protéine -1 min -1. respectivement. Effet de l'indinavir sur Bilirubine Expression dans des cellules Rat UGT hépatome. Pour déterminer si l'indinavir exerce également un effet au niveau de la transcription ou de la traduction, nous avons analysé l'expression de la bilirubine UGT cellules d'hépatome de rat en culture H35. Les monocouches ont été cultivées pendant 18 heures en présence ou en l'absence d'indinavir, après quoi l'ARN cellulaire total a été isolé et soumis à un transfert de Northern avec une sonde d'ADNc spécifique de l'exon 1 de UGT1A1 et avec une sonde non spécifique (englobant les exons 2 à 5) qui hybrident avec tous les isoformes UGT. Une augmentation de deux fois de l'ARNm UGT1A1 a été observé que la concentration de l'indinavir a été augmentée de 0 à 50 uM (Fig. 3 à gauche), en l'absence d'un effet démontrable sur les niveaux totaux d'ARNm UGT1A (Fig. 3 Center). En revanche, l'addition de 50 uM indinavir au milieu d'incubation était associée à une (29%) diminution non significative de la bilirubine expression de la protéine UGT, évaluée par Western Blot des isolées microsomes de cellules H35 (Fig. 3 à droite). Effet de l'indinavir sur l'expression dans les cellules UGT hépatome de rat. Des monocouches de cellules d'hépatome de rat de H35 ont été cultivées pendant 18 heures en présence de l'indinavir (0-50 pm). Les cellules ont été récoltées et 25 pg d'ARN cellulaire total ont été soumis à un transfert de Northern avec une sonde d'ADNc de souris spécifique de l'exon 1 de UGT1A1 (gauche) et avec une sonde non spécifique UGT (centre). Les transferts ont été déshabillés et rehybridized avec l'ADNc pour ubiquitine pour contrôler le chargement (Basse). (Droite) H35 cellules ont été récoltées après une 18 h d'incubation en l'absence (-) ou en présence (+) de 50 pM indinavir, et la fraction microsomale (30 ug de protéine) ont été soumises à une SDS / PAGE sur un gel à 10%. La voie finale contient les microsomes de foie de rat (m) en tant que témoin. Transfert de Western a été réalisée avec l'antisérum de lapin (1: 2000 dilution), et une bande de 55 kDa correspondant à la bilirubine UGT a été identifiée. Comparaison des niveaux de bilirubine dans Wistar et hétérozygote Gunn rats traités avec indinavir. Les résultats des expériences précédentes in vitro suggèrent que hyperbilirubinémie résultats induits par indinavir-de l'inhibition directe de l'activité de la bilirubine UGT. Cette hypothèse a été testée in vivo en utilisant des rats Gunn, une souche mutante de rat Wistar possédant une déficience héréditaire de l'activité hépatique de la bilirubine conjugaison causée par une mutation du cadre de lecture -1 dans le gène UGT1A1 (27). Les animaux homozygotes (j / j) pour la mutation Gunn sont manifestement aigri à cause de l'absence d'UGT1A1 hépatique (28. 29). En revanche, les hétérozygotes (j / +) rats Gunn présentent des taux de bilirubine plasmatique basale normale malgré les activités enzymatiques qui sont ≈50% que de leur type sauvage (+ / +) homologues Wistar (28). En effet, la concentration moyenne de la bilirubine du plasma en J / + animaux (0,054 ± 0,002 mg / dl ± SE) n'a pas été significativement différent (p = 0,13) à partir de + / + témoins (0,050 ± 0,002 mg / dl) (figure 4). . Effet de l'indinavir sur les niveaux de bilirubine plasmatique chez Wistar et les rats Gunn hétérozygotes. (Upper) La concentration de la bilirubine totale dans le plasma de type sauvage (+ / +) Wistar (n = 6, cernes) et hétérozygote rats avant (j / +) Gunn (n = 6, cercles gris) (pré) et après (post) recevoir quatre doses d'indinavir (240 mg / kg) toutes les 8 h par gavage. Les taux moyens de bilirubine plasmatiques ont augmenté de 0,050 ± 0,002 à 0,070 ± 0,003 mg / dl (± SE) en + / + rongeurs (P 0,0001) et de 0,054 ± de 0,002 à 0,096 ± 0,007 mg / dl (P = 0,0007) dans j / + animaux. (Basse) le changement de la concentration de la bilirubine plasmatique, stratifiée par le génotype, est tracée pour chaque animal. Les lignes reflètent les valeurs moyennes pour le + / + (0,018 ± 0,004 mg / dl) et j / + (0,043 ± 0,008 mg / dl) rats (P = 0,02). Spécule que hyperbilirubinémie sera plus prononcé dans des conditions où l'activité hépatique de la bilirubine est réduite de conjugaison, nous avons examiné l'effet de l'indinavir la concentration de la bilirubine dans le plasma de + / + et j / + rats. Les animaux ont été administrés indinavir à une dose de 240 mg / kg toutes les 8 h par gavage, et des échantillons de sang dans la veine caudale ont été obtenus avant le traitement et 3 h après la quatrième dose. Comme on le voit sur la Fig. 4 (Upper), le taux de bilirubine plasmatiques ont augmenté dans les deux groupes d'animaux après le traitement. Toutefois, la hausse moyenne de la bilirubine plasmatique était significativement plus élevée dans le Gunn hétérozygote (j / +) rats (0,043 ± / dl, ± SE 0,008 mg) versus type sauvage (+ / +) animaux (0,018 ± 0,004 mg / dl) (Fig. 4 Basse). En particulier, les taux hépatiques d'UGT1A1 ARNm et la protéine ont également été considérablement plus élevée chez les rats indinavir traités par rapport aux non traités + / + et j / + animaux (Fig. 5), ce qui suggère que le médicament n'inhibe pas la conjugaison de la bilirubine, en supprimant l'expression de l'enzyme. La conclusion selon laquelle l'hyperbilirubinémie est plus prononcée chez les animaux ayant une activité réduite de la bilirubine UGT est compatible avec l'hypothèse que l'indinavir est en concurrence avec la bilirubine pour la conjugaison. expression hépatique chez les rats UGT d'indinavir traités et non traités. L'ARN total a été isolé à partir de foies de non traitées (-) hétérozygote Gunn (j / +) et de type sauvage Wistar (+ / +) rats et d'animaux traités avec quatre doses d'indinavir (240 mg / kg) toutes les 8 h par gavage (+). Northern blot (25 ug d'ARN) a été réalisée en utilisant une sonde d'ADNc murin spécifique pour l'exon 1 de UGT1A1 (supérieur gauche) et une sonde non spécifique UGT (supérieur droit). (Basse) 500 ug d'homogénat ensemble du foie (à gauche) et 50 ug de microsomes hépatiques isolés (à droite) de l'indinavir traités (+) et non traitées (-) des rats a été soumis à Western blot avec un antisérum de lapin (dilution 1: 500). Influence du polymorphisme du Gilbert sur indinavir-Induced hyperbilirubinémie chez les patients infectés par le VIH. Nous avons cherché à étendre les résultats de nos études sur les rongeurs à l'homme en analysant une série de patients infectés par le VIH qui suivent un traitement avec l'indinavir. Un total de 15 patients de sexe masculin qui avaient reçu l'indinavir pour un minimum de 4 semaines ont été criblées pour la boîte TATA la mutation de Gilbert, et les résultats en corrélation avec les taux de bilirubine sérique post-traitement et de prétraitement. Les données démographiques et biologiques sont résumées dans le tableau 1. Les polymorphismes dans la région promoteur du gène UGT1A1 ont été caractérisés par une analyse par PCR de l'ADN isolé à partir de lymphocytes du sang périphérique (Fig. 6). Conformément aux rapports précédents (12. 14. 30), les concentrations de bilirubine de base dans des échantillons de sérum obtenus avant le début du traitement indinavir en corrélation avec le nombre des allèles de Gilbert (P = 0,037). Les taux moyens de bilirubine sérique étaient significativement plus élevés chez les patients homozygotes pour A (TA) 7 TAA (0,96 ± 0,22 mg / dl) que dans A (TA) 6 homozygotes TAA (0,50 ± 0,28 mg / dl), avec des individus hétérozygotes présentant des niveaux intermédiaires ( 0,75 ± 0,19 mg / dl). Les données démographiques et de laboratoire pour les patients infectés par le VIH traités par indinavir Le génotypage des polymorphismes du promoteur UGT1A1. Les échantillons d'ADN provenant de cinq patients infectés par le VIH séparés ont été amplifiés par PCR en utilisant des amorces spécifiques de la région du promoteur UGT1A1 et soumis à une électrophorèse sur un gel d'acrylamide à 12%. La présence de A (TA) 6 Résultats TAA alléliques dans un produit de PCR de 71 pb, tandis que l'AAT allèle A (TA) 7 donne un fragment de 73 pb. Les génotypes sont attribués comme suit: 6/6, homozygote pour le type sauvage A (TA) 6 TAA allèle; 7/7, homozygotes pour l'allèle A (TA) 7 TAA Gilbert; 6/7, hétérozygote pour le A (TA) 6 TAA et A (TA) 7 allèles TAA. La concentration de la bilirubine totale dans le sérum a augmenté dans 13 des 15 patients après avoir reçu l'indinavir (Fig. 7 Upper), principalement en raison d'une augmentation de la fraction non conjuguée (indirecte) (tableau 1). Hyperbilirubinémie a été plus prononcée chez les individus possédant un ou les deux A (TA) 7 allèles TAA par rapport A (TA) 6 homozygotes TAA (Fig. 7 Basse), avec des niveaux de bilirubine post-traitement moyenne de 2,36 ± 1,27, 2,17 ± 0,75 et 0,84 ± 0,46 mg / dl, respectivement. L'analyse des données en utilisant un modèle de régression séquentielle indique que la présence de la mutation de Gilbert est hautement prédictive de post-traitement des niveaux de bilirubine (P = 0,012). Sur la base de l'absence d'une baisse concomitante dans le sérum hémoglobine (tableau 1), l'hémolyse induite par le médicament est peu probable d'avoir contribué à l'augmentation des concentrations de bilirubine. Même dans le sous-groupe de six patients présentant une supérieure à 1 mg / dl augmentation de la bilirubine sérique, les taux d'hémoglobine avant (13,9 ± 1,5 g / dl) et après (13,9 ± 1,2 g / dl) de traitement sont demeurés inchangés. les niveaux post-traitement de l'albumine sérique et l'alanine aminotransférase étaient normaux (tableau 1), en faisant valoir contre la dysfonction hépatique sous-jacente, et aucune corrélation entre la présence de l'hépatite virale et de la bilirubine sérique a été trouvé. Influence du polymorphisme de Gilbert sur les niveaux de bilirubine sérique chez les patients infectés par le VIH traités par indinavir. (Upper) Les concentrations de bilirubine totale de sérum pour les patients individuels avec promoteur UGT1A1 génotype 6/6 (cercles noirs), 6/7 (carrés gris) et 7/7 (triangles gris) avant (pré) et après (post) recevant un minimum de 4 semaines de l'indinavir orale. (Basse) La variation de la concentration de bilirubine sérique pour chaque patient après traitement indinavir est stratifié pour l'absence (6/6, cernes) ou en présence (6/7, cases noires, ou 7/7, triangles gris) de la mutation du Gilbert . Les valeurs moyennes pour chaque groupe (lignes pleines) étaient de 0,34 ± 0,29 mg / dl et 1,45 ± 0,99 mg / dl (± écart-type), respectivement (P = 0,030). Discussion L'indinavir est un inhibiteur puissant et communément utilisé protéase qui a été montré très efficace contre le VIH lorsqu'il est utilisé en association avec des inhibiteurs de la transcriptase inverse (2. 3). hyperbilirubinémie est un effet secondaire fréquent de ce médicament, qui peut confondre la gestion médicale. Les résultats de nos études in vitro indiquent que les causes indinavir ont augmenté le taux de bilirubine non conjuguée dans le sérum par inhibition compétitive de l'activité bilirubine UDP-glucuronyltransférase. Notre conclusion que le traitement indinavir est associée à une augmentation des niveaux de UGT1A1 hépatiques plaide contre un mécanisme impliquant la drogue médiée par la régulation de l'expression enzyme et soutient en outre que l'hyperbilirubinémie induite par indinavir-est en raison de l'inhibition directe de l'activité enzymatique. Fait intéressant, des études antérieures ont montré que la bilirubine est un puissant inhibiteur de la protéase du VIH-1 (31), ce qui suggère que la bilirubine peut partager une homologie structurale avec d'autres inhibiteurs de la protéase. À cet égard, le saquinavir inhibe également l'activité de l'UGT bilirubine d'une manière compétitive. L'absence d'une association de ce médicament avec l'hyperbilirubinémie clinique est probable en raison de la 2 fois plus élevée K I et 40 fois les concentrations sériques maximales inférieures par rapport à indinavir (32). Nos données confirment une forte association entre la présence de l'allèle de Gilbert et le risque de développer une hyperbilirubinémie sur indinavir, fournissant des preuves directes pour un effet pharmacologique pertinente de ce qui est généralement considéré comme une affection bénigne. En fait, seuls les patients possédant le A (TA) des taux de bilirubine sérique 7 TAA des allèles exposés post-traitement dans la gamme normalement associées à un ictère cliniquement apparente (2,3 mg / dl). Par comparaison avec le génotype 6/6 promoteur, les génotypes 6/7 et 7/7 sont associés à des niveaux médians sensiblement plus faibles de l'activité hépatique de la bilirubine UGT (13). Par conséquent, il en résulte que les personnes qui possèdent le A (TA) 7 TAA allèle manifestera une sensibilité accrue à l'hyperbilirubinémie comme une conséquence de l'inhibition de l'enzyme indinavir médiée. D'une manière analogue, il a été montré précédemment que la présence du polymorphisme de Gilbert est un déterminant majeur des concentrations sériques de bilirubine dans hétérozygote β-thalassémie et en glucose-6-phosphate déshydrogénase (23). Il est à noter qu'une proportion de patients infectés par le VIH qui possèdent le TAA allèle A (TA) 7 ne hyperbilirubinémie manifeste sur indinavir. Nous postulons que ce soit en raison de la variabilité bien documentée dans l'expression phénotypique de la mutation du Gilbert (13), avec l'hyperbilirubinémie manifestant chez les patients ayant les plus faibles niveaux d'activité UGT hépatique. Alternativement, il a été proposé qu'un défaut simultané hépatique transport anionique organique est présent chez les personnes atteintes du syndrome de Gilbert qui manifestent hyperbilirubinémie de base (33). Ces mêmes patients sont susceptibles de se présenter une sensibilité accrue à l'indinavir. Contre cette possibilité, cependant, est l'absence d'une corrélation entre les niveaux de bilirubine post-traitement pré-traitement et dans nos patients de l'étude. Peu importe, nos données indiquent que la présence de la mutation de Gilbert prédispose les patients infectés par le VIH à l'hyperbilirubinémie induite par l'indinavir. Chez les individus possédant le A (TA) 7 TAA allèle, le développement des niveaux sériques élevés de bilirubine non conjuguée après le début de l'indinavir, en l'absence d'autres anomalies des tests hépatiques, semble représenter un processus bénin. En fait, il existe des preuves pour suggérer que la bilirubine réduit l'infectivité du VIH (31); Par conséquent, l'induction de l'hyperbilirubinémie peut en réalité améliorer l'efficacité du traitement. Remerciements Nous remercions Mme Tammy Powell pour l'assistance technique. Ces études ont été soutenues par les Instituts nationaux de la santé des subventions de recherche DK-51679 (à S. D.Z.), AI-25897 (à J. F. et K. E.S.), et HD-40027 (à R. M.G.) et un mérite récompense Anciens Combattants Hôpitaux (à R. M.G.).